Antonio Alcaide Raya
Experto en Reproducción Asistida

La Hemofilia, en cualquiera de sus formas, es una enfermedad genética grave que compromete seriamente la calidad de vida de quienes la sufren. A los problemas derivados directamente de padecer la enfermedad, se suma la ansiedad de saber que la futura descendencia también puede estar afectada. Hasta hace menos de una década, la única opción para las parejas en las que algún miembro era portador o afecto de Hemofilia era la adopción o el diagnóstico prenatal asumiendo el riesgo de tener que interrumpir el embarazo. Actualmente, combinando técnicas de reproducción asistida con otras de citogenética y genética molecular, se puede adelantar el momento del diagnóstico al estado embrionario, evitando la posibilidad del aborto terapéutico e incluso haciendo posible interrumpir la cadena de transmisión de la enfermedad. A lo largo de este artículo, se revisará la actualidad del Diagnóstico Genético Preimplantacional (DGP) aplicado a la Hemofilia.

Tratamiento de reproducción asistida con DGP 

Cuando una pareja portadora o afecta de Hemofilia acude a un centro de reproducción asistida para conseguir descendencia sana, el proceso que viene a continuación no difiere demasiado del seguido por cualquier pareja cuya indicación para el tratamiento sea la esterilidad. Así, además de atender todo lo referido a la Hemofilia, se realiza una anamnesis profunda de la pareja desde el punto de vista reproductivo que incluirá, al menos, un seminograma del varón además de un perfil hormonal y una revisión ecográfica de ovarios y útero de la mujer. De esta manera se comprueba la calidad seminal, la situación de la reserva ovárica y cualquier problema uterino que comprometiera la función reproductora de la pareja. A este respecto, un factor importante a tener en cuenta es la edad materna, por cuanto condiciona decisivamente la calidad de los oocitos (óvulos) y, por lo tanto, las opciones de conseguir un embarazo.

De los resultados obtenidos durante el estudio inicial de la pareja depende la elección del tratamiento a seguir. Sin embargo, cuando la pareja es portadora o afecta de una genopatía como la Hemofilia, la Fecundación in Vitro (FIV) es el tratamiento de elección porque es el único que permite disponer de embriones in Vitro para analizarlos genéticamente. El empleo adicional de la microinyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), dependerá de la existencia de un factor masculino severo y de si el posterior análisis genético de los embriones va a ser molecular y no citogenético. Cualquier tratamiento de FIV o de FIV-ICSI comienza con la administración de análogos o antagonistas de la GnRH para suprimir la hipófisis y anular la secreción de FSH y LH. De esta manera el control del ciclo ovulatorio pasa de ser endógeno a depender de la administración exógena de gonadotropinas. Estas, en dosis superiores a las fisiológicas, provocan el desarrollo simultáneo de varios folículos intraováricos. Se busca obtener entre 8 y 12 folículos para aumentar al máximo la probabilidad de tener embriones de buena calidad sin llegar a provocar un síndrome de hiperestimulación ovárica.

Cuando los folículos, en cuyo interior están los óvulos, tienen un tamaño superior a 22 mm, se induce la maduración de los segundos administrando β-hCG, cuya función equivale al pico ovulatorio de LH que no se produce de forma endógena por la inhibición hipofisaria. 35 horas después de la inyección de β-hCG se extraen los folículos por punción ovárica transvaginal con control ecográfico, en una intervención que no dura más de 15 min. Ya en el laboratorio, los óvulos se aíslan del resto del material folicular y se cultivan en medios adecuados a sus requerimientos nutricionales mientras se mantienen en condiciones de pH, humedad y temperatura adecuadas para preservar su viabilidad. Por su parte, la muestra de semen es procesada para seleccionar los espermatozoides de mayor capacidad e inseminar con ellos los óvulos obtenidos durante la punción ovárica. Entre 16 y 20 horas tras la inseminación se puede ya comprobar cuántos óvulos de los inseminados han fecundado. A las 72 horas de la inseminación, los embriones habrán ido completando sucesivas divisiones mitóticas hasta tener entre 6 y 8 células —o blastómeros—. En este momento se puede extraer por biopsia 1 ó 2 células de cada embrión sin afectar significativamente a su desarrollo. Sobre cada una de las células obtenidas de cada embrión se realiza el análisis genético que nos sirve para decidir qué embrión es afecto, portador o sano de la enfermedad genética o anomalía cromosómica que necesitemos estudiar. Mientras tanto, los embriones que han sido biopsiados continúan su desarrollo en los medios de cultivo adecuados y, solo si su perfil genético y/o cromosómico es el correcto, serán transferidos al útero materno, donde en interacción con la pared endometrial, podrán implantarse y dar lugar a una gestación evolutiva que llegue a término.

Diagnóstico genético 

El estudio genético al que podemos someter los blastómeros puede ser de dos tipos: citogenético si queremos estudiar posibles aneuploidías o determinar el sexo del embrión o molecular, si queremos conocer la integridad de un gen o genes concretos. En ambos casos, es necesario aislar el núcleo de cada blastómero rompiendo la membrana celular y digiriendo todo el material citoplasmático.

Diagnóstico citogenético

Se basa en el estudio del número cromosómico y/o de la integridad estructural de los cromosomas. Se lleva a cabo mediante Hibridación in Situ Fluorescente (FISH) y consiste en aislar y fijar el ADN nuclear sobre un portaobjetos haciéndolo hibridar con secuencias de nucleótidos (sondas de ADN) complementarias de regiones concretas y exclusivas de cada cromosoma a estudiar. Las sondas están marcadas con fluorocromos de diferente color para cada cromosoma. Posteriormente, en un microscopio de fluorescencia, se verán las señales coloreadas que se corresponden con cada par cromosómico.

El estudio citogenético en la Hemofilia permite, marcando con distintos colores cada uno de los cromosomas sexuales, saber si en el embrión hay una dotación sexual XX ó XY lo que, atendiendo a lo expuesto en el Cuadro I, será de utilidad para seleccionar los embriones dependiendo de la situación de los padres respecto a la enfermedad.

En la situación c), la mejor alternativa es recurrir al DGP molecular aunque, ante lo elevado del coste y la mayor complejidad de este último, hay parejas que deciden no hacerlo y recurrir al diagnóstico citogenético asumiendo los inconvenientes que se han referido.

Aunque la fiabilidad de esta técnica se sitúa por encima del 95%, puede haber algunos errores de diagnóstico atribuibles principalmente a casos de mosaicismo embrionario y a fallos de hibridación imposibles de subsanar por falta de tiempo, ya que los embriones han de ser transferidos en las 48 horas siguientes a la biopsia.

Diagnóstico genético-molecular

A diferencia de la citogenética, que analiza el número y la estructura de los cromosomas, la genética molecular estudia la integridad de los genes mismos. Siempre que, como en el caso de la Hemofilia, se conozca el gen involucrado en una genopatía, será posible el diagnóstico molecular de la misma, ya sea de forma directa o indirecta.

a) Diagnóstico molecular directo

Se trata de detectar una alteración concreta en la secuencia de nucleótidos del gen en estudio. Solo se puede aplicar cuando se conoce con exactitud la secuencia nucleotídica correcta y la alteración de la misma que se pretende identificar. Técnicamente, el procedimiento consiste en amplificar por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) el ADN de cada blastómero y tratarlo después con enzimas de restricción específicas, cuyos sitios de acción se encuentran en el gen que está en estudio. El resultado de la acción de estos enzimas es la fragmentación del ADN génico y, el tamaño de los fragmentos generados, será lo que permita decidir si el gen presenta o no la anomalía buscada.

Como alternativa al análisis de fragmentos, en los últimos años el diagnóstico molecular directo se lleva a cabo secuenciando directamente el gen, o porción del gen, que se supone alterado.

Mientras las situaciones a) y c) no ofrecen dudas, la b) plantea dos problemas derivados de no poder distinguir las portadoras: Seleccionando para la transferencia los embriones XX, el 50% de ellos pueden ser portadoras y no se rompería la cadena de transmisión de la enfermedad; el 50% de los varones descartados pueden ser sanos.

En ocasiones, aunque se conoce qué gen está en relación con una enfermedad, no está identificada la alteración concreta que la provoca. En estos casos la única posibilidad para comprobar si un embrión ha heredado una genopatía materna o paterna es hacerlo de forma indirecta, por análisis de ligamiento. Para ello, se ha de localizar un grupo de marcadores polimórficos (regiones del ADN sin función aparente que varían de secuencia nucleotídica entre individuos) que flanquean el gen o, mejor aún, intragénicos, de forma que durante las divisiones meióticas no se vean afectados por el sobrecruzamiento de los cromosomas y segreguen junto con la porción del gen que está en estudio. La selección de los marcadores variará fundamentalmente en función del área geográfica y la raza de la población que se está tratando ya que han de presentar un grado de heterocigosidad suficiente para resultar informativos. Una vez seleccionados los marcadores, se establecerá su haplotipo para los progenitores, de los abuelos por parte del progenitor afecto y de cada embrión. Comparando el haplotipo de los embriones con los de los familiares de interés, se podrá deducir cuál de estos ha heredado la enfermedad.

El estudio molecular indirecto también es de utilidad cuando el gen implicado en la genopatía es muy grande para poder ser secuenciado con éxito y las mutaciones o alteraciones posibles de su secuencia nucleotídica son muchas. La Hemofilia A es uno de estos casos, como lo es la fibrosis quística, con más de 700 mutaciones descritas.

Dificultades del DGP molecular 

Técnicamente, el DGP molecular presenta algunas dificultades que pueden comprometer la fiabilidad del resultado. La más importante de ellas es el fenómeno de ADO (“Allele Drop Out”) en el que uno de los alelos no se amplifica, pudiendo interpretar como homocigoto un embrión heterocigoto. Esto es especialmente relevante en el caso de las enfermedades monogénicas dominantes si el alelo que no se amplifica es el afecto. El motivo que provoca ADO no está del todo claro aunque parecer tener relación directa con el hecho de trabajar con cantidades muy pequeñas de ADN.

El tiempo que duran los estudios genéticos en la pareja (y probablemente en los padres de ésta) para identificar una mutación o para comprobar la información de los marcadores elegidos puede durar entre 3 y 6 meses. Esta espera aumenta mucho la ansiedad de la pareja al tiempo que puede restar opciones de gestación si la edad materna está cercana a los 40 años.

Otro escollo que presenta el DGP molecular es el elevado coste para el paciente a lo que, además, hay que sumar el precio de la medicación y el tratamiento de reproducción asistida.

Conclusiones 

La genética se ha incorporado de manera definitiva al campo de la reproducción asistida ampliando las indicaciones de los tratamientos de esterilidad a parejas portadoras de algún riesgo genético para la descendencia.

El Diagnóstico Genético Preimplantacional, que ya es casi una rutina en la mayoría de centros de esterilidad, ofrece resultados alentadores y son muchas las parejas que se han beneficiado de ella. No obstante, en el caso de determinadas cromosomopatías y la mayoría de las enfermedades monogénicas, aún ha de ser considerada una técnica experimental y todas las gestaciones que han pasado por un DGP deben someterse a diagnóstico prenatal.

El DGP puede llevarse a cabo utilizando técnicas de citogenética y/o de genética molecular. El diagnóstico citogenético presenta menor complejidad y es más inmediato en el tiempo que el molecular que, además, es mucho más costoso. Sin embargo, en el caso de la Hemofilia, la citogenética no permite identificar los embriones portadores, lo que, salvo en el caso de padre hemofílico y madre sana, es, cuando menos, aconsejable el diagnóstico genético molecular.

Referencias 

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